martes, 24 de julio de 2007

Contraste de fases

La microscopía de contraste de fases es una técnica que permite ver con bastante detalle y buen contraste aquellos objetos tan transparentes, que son prácticamente invisibles con la luz ordinaria. Sirve también para detectar diferencias muy pequeñas de grosor y densidad del objeto, sin necesidad de alterarlo por tinción o por cualquier otro procedimiento, de modo que podemos ver células y tejidos vivos en su estado natural.
Como ya se sabe, la luz se propaga en forma de onda sinusoidal, caracterizada por su amplitud o altura y longitud de onda. El ojo es sensible a los cambios de longitud de onda (color) y de amplitud (luminosidad), pero no a los cambios de fase, producidos por el retraso de un rayo luminoso con respecto a otro. Los elementos biológicos por lo general tienen un espesor bastante uniforme y un índice de refracción que igualmente experimenta poca diversidad. Pero, el índice de refracción no es necesariamente idéntico al del medio circundante, así, la luz que atraviesa el objeto será de diferente fase a la que atraviesa el medio circundante. El contraste no es suficiente para hacer visible al objeto, porque, porque estas mínimas variaciones son imperceptibles al ojo humano.
El contraste de un objeto no coloreado depende de su capacidad para alterar la forma de onda por retardación o absorción. La luz que atraviesa las partes más densas de un objeto aparece oscura. También la luz refractada en diversos grados se retrasa y, a causa de la interferencia de anulación con otros rayos menos retardados, aparece más oscura. Por consiguiente, el contraste es la consecuencia de la interferencia de los rayos luminosos entre si.
Si dos rayos luminosos procedentes de un cuerpo inciden en el mismo punto de la pantalla, la intensidad de la luz resultante será igual a la suma de sus amplitudes. En cambio, si uno de los rayos ha sido retardado en media longitud de onda, en vez de aumentar la luminosidad en la pantalla no habrá ninguna luz porque la parte inferior de una onda luminosa anula la parte superior de la onda contigua. En consecuencia, la interferencia mutua de las ondas luminosas puede causar la extinción total o parcial de la luz, según las amplitudes relativas de los rayos en cuestión.
El contraste de fases se basa en la intensificación de del retraso de onda luminosa, refractada por la preparación microscópica. La luz refractada por una preparación suele retrasarse aproximadamente un cuarto de longitud de onda, si se aumenta esta retardación hasta media longitud de onda, la luz que atraviesa directamente la preparación causa una interferencia de anulación con la luz refractada y se producen diferencias de amplitud fácilmente visibles.
Los requisitos básicos del microscopio de contraste de fases son: una placa de retardación situada en el plano focal posterior del objetivo y un diafragma anular en el condensador.
La placa de fase consiste en un disco de vidrio provisto de un canal o depresión circular, tratada con un material que se absorbe la luz, pero que no le retarda. El resto de la placa posee una fina película de fluorita de magnesio u otra sustancia, que retarda la luz en un cuarto de longitud de onda. La luz que pasa directamente por el objeto y el canal o ranura es tardada en un cuarto de longitud de onda menos que la luz refractada que pasa por el resto de la placa. En consecuencia, la luz refractada por el objeto queda retrasada en un total de media longitud de onda con respecto a la que pasa por el canal. La interferencia de los rayos Desviados y directos produce los efectos de contraste de fases, el material fonoabsorbente reduce la luminosidad de la luz directa y hace que el contraste pueda apreciarse claramente.

Esta técnica tiene la finalidad de realizar el contraste de fases. En este caso se utiliza un microscopio con iluminación Köhler al que se le enciman los anillos oscuro del objetivo y claro del condensador. Para esto se debe contar con objetivos para contraste de fases, marcados Ph1, Ph2, Ph3, que significa fase 1, fase 2 y fase 3 respectivamente y un condensador para contraste de fases. Basta con poner el objetivo Ph1 y el condensador en 1, quitar un ocular y poner una lente auxiliar y colocar el ocular para observar la preparación.
En el resultado final podremos observar en la muestra sin colorante estructuras que en campo claro sería imposible distinguir. Para los otros objetivos deberá utilizarse el condensador en 2 ó 3 según la “phase” ya que de esto depende que el tamaño de los anillos corresponda y sea posible superponerlos.
La óptica del microscopio de fases está calculada para modular longitudes de onda de 550nm por lo que siempre debe usarse un filtro verde en la salida de la lámpara.

Bibliografía:

* Técnicas en Biología Celular; Ma. Genoveva González-Morán; AGT Editor, 1996.